常见问题解答-常见问题
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识别AC-4a荧光核型的技巧；问:观察AC-4a荧光核型有什么好的建议吗？
要关注AC-4a核斑点图片上的无数特征小点，应调整准焦螺旋来观察可能出现在不同焦平面上的略微小点。AC-4a的特征在初始1/80稀释时可能不明显，但随着样本进一步稀释会变得更清晰。一般来说，400倍的放大倍数更适合观察AC-4a的荧光核型，其特征是具有无数微小的针状点，大小略有变化。此外，我们注意到AC-4a在某些HEp-2载片品牌(如Bion-MBL、Aesku、Medipan、BIO-RAD和Inova)中比在其他品牌中更明显，这可能取决于不同制造商应用的细胞培养和固定方法的不同细节。因此，需要确定在实验室中使用的特征HEp-2荧光片品牌中AC-4a的核型。IUIS/ASC参考血清IS2105的可用性也将有助于实验室有效地识别这种AC-4a荧光核型。总之，识别AC-4a的最佳技巧是要有充足的时间和一个好用的显微镜，而不是仅仅依靠自动阅片系统。日期：2021年12月01日
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确定HEp-2 IFA的荧光核型所需的放大倍数是多少？ 问:ICAP是否明确说明了HEp-2 IFA染色荧光核型在确定荧光核型之前应该评估的放大倍数？
答:在文献中，人们普遍认为，直接通过显微镜阅片时，准确评估HEp-2细胞上的IFA荧光核型需要至少400倍的总放大倍数(40倍物镜和10倍目镜)。但是，ICAP执行委员会没有作出类似的声明。
很多半自动IFA阅读器使用200倍的放大倍数，这足以解释许多荧光核型。然而，在半自动仪器(或传统显微镜)上拍摄的数字图像与通过显微镜目镜观看的实时图像不同。对于提交给ICAP的图像，建议最小放大倍数为400x。
为了更好全面地观察AC-29的5个特征(topo I-like)和AC-4a的核微小斑点，建议使用400倍的放大倍数。此外，在大多数情况下，还需要400倍的放大倍率来区分核仁荧光核型(AC-8、9、10)和核膜荧光核型(AC-11、12)。
日期：2021年11月18日
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多重、混合和复合HEp-2 IFA荧光核型的区别？问:您能提供更多关于ICAP如何定义HEp-2 IFA中多重、混合和复合荧光核型之间的差异的信息吗？
答:当我们观察到明确的单个的HEp-2 IFA荧光核型时，我们指的是单一核型，例如AC-23或AC-3。术语多重、混合和复合IFA荧光核型指的是多于单一核型但不同的概念。
1. 术语“多重荧光核型”适用于在单个血清样本中观察到两种或两种以上个体和明确可识别的荧光核型的情况，例如AC-1 + AC-23或AC-4 + AC-22(即，每种荧光核型都被清楚识别)。
2. 术语“混合荧光核型”适用于血清样本在同一细胞区域中产生多种模式并且不可能清楚地识别每种成分的观察。例如，AC-4 + AC-5通常可以一起看到，但我们无法区分每个组件(AC-4和AC-5);在这些病例中，HEp-2 IFA染色荧光核型被认为是混合核斑点荧光核型。
3.最后，术语“复合荧光核型”适用于单个抗体引起两个或多个细胞区域染色的情况，并且复合图形具此特征，以至于它总是引起该自身抗体的存在。例如，AC-26荧光核型是伴随有丝分裂纺锤体纤维染色的间期核染色荧光核型，通常与抗NuMA抗体相关。同样，AC-14模式，通常与抗CENP- F抗体相关，其特征是在间期细胞中具有可变强度的核细斑点染色，仅在有丝分裂细胞中具有精细的着丝粒染色，细胞间桥染色，而在前期细胞中仅具有核包膜染色。
日期：2021年11月18日
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AC-18 的报告会随着2021年分类树的修订而改变吗？ 问:我对新的分类树有一个问题。将AC-18从细胞质有斑点的类别中删除，并仍被指定为专家级。如果实验室只报告基础级别的荧光核型，AC-18应该如何报告?他们是否应该将分类树的第一个分支报告为“细胞浆”？
答:希望报专家级别核型的实验室应开始训练阅读HEp-2 IFA荧光核型，首先要专注于涵盖所有基础级别的荧光核型。换句话说，基础级核型涵盖了HEp-2 IFA实验室检测报告的所有必要荧光核型。然而，ICAP并不意味着实验室应该止步于只报基础及级核型的想法。
因此，如果实验室能够识别出AC-18(胞浆散点型)，他们就可以将其报告为AC-18。那么，我们应该如何认可一个能报告AC-18的实验室?理想的做法是建立AC-18的内部标准参比(基于IUIS自身抗体标准化委员会https://asc.dental.ufl.edu/reference-sera/提供的外部参比物质)，并在有新批次时检查HEp-2底物。确保了他们能够识别AC-18。
如果实验室不认可上述政策/参考的AC-18，他们可报告为细胞浆型。
日期：2021年10月24日
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准确的IFA细胞染色模式在低稀释度下被掩盖？ 问：在对一名 9 岁狼疮女性患者进行 IFA 检测时，在初始稀释度1:40时产生了明亮且模糊的细胞质染色，没有明确对应的细胞染色模式。令人惊讶的是，在1:160稀释度下可观察到核细颗粒型AC-4。在低稀释度下细胞质染色完全掩盖细胞核染色的情况是否常见？
答：这种现象大部分人还未关注到，但在某些情况下可能会出现。一些样本在低稀释度下出现明确的阴性HEp-2 IFA结果，当我们对样本进行稀释后会逐渐发现他们具有良好且明确的反应性。这并不意味着我们需要对每个阴性的样本进行1:80的稀释，但对于那些在1:80稀释度下出现明亮且模糊荧光染色（无明确对应的细胞染色模式）的样本可能值得尝试。在某些情况下，未能发现这一潜在问题可能会导致假阴性结果。日期：2021年10月24日
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HEp-2 IFA检测低滴度抗dsDNA血清呈阴性？ 问：在1:20稀释度下使用绿蝇短膜虫检测呈dsDNA阳性的样本使用HEp-2 IFA检测是否会得到阴性结果？通过不同厂牌的商品化试剂确认了HEp-2 IFA为阴性。
答：在大多数情况下，含有抗 dsDNA 抗体的样本与核均质型 (AC-1) 相关。在极少数情况下无法观察到细胞核染色，因为样本所含抗体能识别的DNA表位存在于高度浓缩的绿蝇短膜虫动基体DNA中，但不存在于常用的商品化HEp-2细胞中。在这种情况下，使用另一个厂牌的 HEp-2 试剂盒进行 HEp-2 IFA的结果验证可能会有所帮助，结果可能为阳性，也可能仍为阴性。就您的情况而言，很明显您已经确认了不同商品化试剂盒都为阴性结果。在某些情况下，DNA与细胞核中的组蛋白和其他蛋白质（例如高迁移率族蛋白）相互作用而隐藏了抗 dsDNA 抗体靶向的DNA表位。在这种情况下，在 IF 实验之前用 0.1N HCl 提取组蛋白和其他核蛋白可能会使抗 dsDNA 抗体正常反应产生预期的AC-1荧光模式。最后，您需要确认您在绿蝇短膜虫为底物检测抗dsDNA抗体时观察到的免疫荧光反应对应于动质体而不是鞭毛基体。日期：2021年10月14日
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IFA模式从核粗颗粒型转变为均质型； 问：一名患者的 HEp-2 IFA染色模式在 6 个月后从核粗颗粒型转变为均质型。这种情况可能发生吗？
答:在所有条件相同的情况下，使用同一生产厂商生产的同批次荧光载片、使用相同的酶结合物和相同的血清稀释度，并确保不存在操作上的技术问题，HEp-2 IFA染色模式可能会随着时间的推移而改变。这可能包括从阴性 (AC-0) 到任何AC编号荧光染色模式的变化，反之亦然。例如疾病进展或重叠综合征、新干预措施（药物、生物制品）、新暴露（传染病、癌症等）等在内的诸多因素都会导致此类变化。了解终点稀释度是否也发生变化（提升或降低至少2个梯度）是非常重要的。
在SLE病程中导致HEp-2 IFA结果变化因素的免疫学基础是什么？自身抗体水平确实会随着病程而波动。其中一些（例如，天然 DNA 和核小体）抗体可能随疾病活动度变化而波动，而另一些（即抗 Ro60 和抗 Sm）抗体的波动似乎独立于疾病活动度。
HEp-2 IFA随时间变化是否与疾病活动相关呢？大多数人都会认为不是，但答案并非这么简单。Andrade 实验室最近的一项研究从横向（活动期x缓解期x非活动期）和前瞻（同一患者在 1 年随访期间疾病活动度的变化）角度评估了 269 名 SLE 患者的 HEp-2 IFA 滴度和染色模式（1）。研究报告显示，染色模式和滴度变化可能会发生变化，并且与疾病活动状态存在一定关联。高滴度和 AC-1 染色模式与活动期疾病相关，而低滴度和 AC-4染色模式与疾病缓解期相关。
有趣的是，HEp-2滴度用于定义疾病活动性的诊断性能（ROC曲线AUC值）处于传统疾病活动度生物标志物（抗dsDNA、抗核小体抗体）的范围内，并且远高于C3和C4。然而，仍不建议将 HEp-2 IFA作为监测 SLE 疾病活动度的检测。相似的结论同样适用于其他与 ANA 相关的风湿性疾病。
因此，回到最初的病例，从 AC-5到 AC-1的变化可能表明抗核小体和/或抗 dsDNA 抗体的出现。建议留意这些自身抗体和可能爆发的疾病。
1. Prado MS, Dellavance A, Rodrigues SH, Marvulle V, Andrade LEC (2020) Changes in the result of antinuclear antibody immunofluorescence assay on HEp-2 cells reflect disease activity status in systemic lupus erythematosus. Clin Chem Lab Med 58:1271-1281. DOI: 10.1515/cclm-2019-0638
日期：2021年10月11日
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有丝分裂染色模式应报告为 ANA 阳性还是阴性？ 问：我应该将阳性的有丝分裂染色模式报告为 ANA 阳性还是 ANA 阴性？
对您问题的简短回答是，当检测到有丝分裂模式（AC-24 至 AC-28）时，应将其报告为 ANA 阳性（请参阅下面的参考资料）。
长答案涉及了一些考虑因素。我们知道世界不同地区的实验室对有丝分裂（甚至细胞质）染色模式的报告方式存在很大差异。一些国家将阳性的有丝分裂染色模式报告为 ANA阳性，其他国家报告为 ANA阴性。即使在一个国家内，也可能会有一些实验室将阳性的有丝分裂染色模式报告为 ANA阳性，而另一些实验室报告为 ANA阴性。因此非常重要的一点是将您报告的检测结果与您实验室所在地的情况和临床实践相互协调。尽管如此，我们建议遵循 www.anapatterns.org上的 ICAP 建议。
最重要的一点是确保您的客户可以理解您出具的结果。 ICAP 建议您避免使用 ANA 阳性或 ANA 阴性等术语。事实上，ANA这个术语已经过时，我们更倾向于抗细胞抗体（参见下面的参考文献）这个新描述。可参考实际的检测内容，即“用 HEp-2载玻片或HEp-2细胞进行的间接免疫荧光检测”作为新描述的过渡。
我们一直在努力传播这样一个概念：HEp-2 IFA的检测结果不仅仅是“阳性”或“阴性”。我们知道临床医生（和实验室）熟悉这种二分概念，但我们也了解到临床医生可以快速学习如何应用HEp-2 IFA染色模式来做出更好的临床决策。
Reference
von Mhlen et al. (2021) How to report the Antinuclear Antibodies (Anti-Cell Antibodies) test on HEp-2 cells: guidelines from the ICAP initiative. Immunol. Res., in press.
日期：2021年09月09日
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HEp-2 IFA结果与蛋白质印迹法结果存在差异。应当如何解释通过蛋白质印迹 (WB) 检测到的抗体与通过间接免疫荧光 (IFA) 在 HEp-2 细胞中检测到的染色模式无关？
这并非一类罕见的现象，对于这种明显的差异有几种可能的解释。
人们认识到每个免疫测定方法学（IFA、WB、ELISA、免疫沉淀 (IP) 等）都依赖于与自身抗原相关的一组特定表位 (1)。广义上，自身抗体能识别线性和/或不连续（天然或构象）表位。在不连续表位的背景下，重要的是要认识到许多自身靶抗原是大分子复合物的一部分，其中独特的表位可能为四级结构。表位结构得到最好保存的免疫测定方法学包括细胞裂解物的免疫沉淀和 HEp-2 IFA。然而，HEp-2 IFA有一条重要的附加说明，由于细胞已固定在甲醇和/或丙酮（或其他非公开的商业机密类的固定剂）中，可能会改变一些表位并暴露其他表位。至于天然表位保存的问题，蛋白印迹存在最大的挑战，因为在变性条件下煮沸蛋白质的做法很可能会显著改变表位。当然有些蛋白质在将电荷转移到硝酸纤维素膜后可能会复性/重折叠，但更多蛋白质不会出现复性/重折叠。当印迹法所检测的抗体与在HEp-2 IFA中观察到的染色模式无关时，一种解释是IFA中识别的抗体表位与印迹法中识别的表位不同或仅代表一部分（甚至不同的表位）。抗原纤维蛋白抗体是其中一个例子； IFA 通常显示 AC-9 模式，但免疫印迹结果呈阴性，因为大部分的抗原纤维蛋白抗体在免疫印迹中不能识别变性的原纤维蛋白。
血清样本（尤其是SLE患者的样本）通常具有不止一种自身抗体特异性。因此，另一种解释是，当两种（或更多种）完全不同的抗体特异性共存于同一血清中时，尤其是在 HEp-2 IFA 上可能会观察到令人困惑的结果。在这种情况下HEp-2 IFA可以反映所有存在的自身抗体的IFA反应性的组合，并且如果血清中只有一种自身抗体特异性，则得到的染色模式可能与预期的染色模式不同。
1. Mahler M, Bluthner M, Pollard KM. Advances in B-cell epitope analysis of autoantigens in connective tissue diseases. Clin Immunol. 2003 May;107:65-79.
日期：2020年08月14日
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抗Ro-52抗体是否有对应的AC荧光核型？已知的ICPA AC命名中是否有可与之匹配的荧光模式。我有一位患者免疫印迹法中只有抗Ro-52抗体+++（强阳），但我不清楚它应该对应哪个AC荧光核型，是AC-4？还是AC-XX？
使用间接免疫荧光法（HEp-2 IFA）检测时，抗Ro-52抗体（也称抗TRIM21抗体）在商业制备的HEp-2细胞中通常不会产生特异的染色荧光核型，在双重免疫扩散或经典放射免疫沉淀测定中也不表现出反应性。针对该现象的一种解释是，这些自身抗体主要识别亮氨酸拉链结构域中的变性表位，而以上检测方法中几乎没有这种表位。而免疫印迹、ELISA、化学发光免疫测定（CLIA）和微粒免疫测定中可很容易地检测到抗Ro-52抗体，这也与上述假设相印证。有报道称利用体外翻译和免疫沉淀分析，在ELISA抗Ro-52阳性的血清中有约50%可检测到抗“天然”Ro-52的抗体[1]。尚不清楚其他免疫检测方法中是否也存在抗体与天然表位之间的结合被阻断的情况。
如果该患者样本使用Hep-2 IFA检测有反应性，它可能含有针对其他抗原的自身抗体而不是针对Ro-52的抗体，换句话说，只具有抗Ro-52反应性的样本使用Hep-2 IFA检测应该是阴性。
1. Buyon JP, Slade SG, Reveille JD, Hamel JC, Chan EKL. Autoantibody responses to the "native" 52-kDa SS-A/Ro protein in neonatal lupus syndromes, systemic lupus erythematosus, and Sjogren's syndrome. J Immunol. 1994 Apr 1;152:3675-84.
日期：2020年06月18日